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硬組織病理切磨技術主要是針對骨組織、帶植入物的骨組織、埋置有堅硬植入物的其他組織標本，或在動物試驗階段進行了親骨熒光素標記的不能進行脫鈣的骨組織，通過脫水、浸潤、包埋處理，由硬組織切磨系統完成的組織病理切片制作的技術。有文獻報道骨組織及埋置堅硬植入物的組織進行病理組織切片制作，通常利用EXAKT硬組織切磨系統［1－3］。硬組織病理切磨技術最顯著的特點是不破壞組織中的植入物，且保持了組織與植入物之間原有的組織結構形態，這對研究組織內植入物的長入情況具有重要意義。本文結合本實驗室日常硬組織制片工作經驗，分析硬組織病理切片制作的每個處理環節，以期能為其他技術人員提供參考。

1.1 組織標本試驗樣品CF/PEEK 復合材料按照國家標準GB/T 16886.6-2015 醫療器械生物學評價: 植入后局部反應試驗的要求進行試驗［4］。動物試驗周期結束后，獲取到埋置有CF/PEEK 復合材料的肌肉組織塊合計36塊。

1.2 主要試劑及儀器設備10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林(濟南百博生物公司) ，無水乙醇( 國藥集團化學公司)，蘇木精染液、伊紅染液(北京索萊寶公司) ，Technovit 7200VLC樹脂試劑盒，EXAKT 300CP硬組織切片機、EXAKT 400CS硬組織磨片機、EXAKT 402平行粘片裝置、EXAKT 510 脫水浸潤儀、EXAKT 520 光固化包埋機、EXAKT 530 干燥滲透聚合裝置( 德國EXAKT 公司) 。

1.3 方法
1.3.1 組織標本的固定組織經10% 中性福爾馬林固定，固定液的量一般為被固定組織標本體積的10 倍。固定24h后，更換新的10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林進一步固定。

1.3.2 組織的切割取材將充分固定后的組織標本經硬組織切片機切割為5mm 厚標本，置于10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林中繼續固定12 h后再進行后續操作。切割取材前應詳細觀察組織標本塊的外觀，詳細了解植入物的植入位置、植入方向、植入深度等。切割取材過程中應防止樣品與組織脫離。切割取材后的組織標本置于自來水中，流水沖洗至少1 h，水流應盡可能的小操作過程應輕柔，以防植入物與組織脫離。

1.3.3 標本脫水將組織標本依次置于50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100% 乙醇Ⅱ，分別脫水48h，不同濃度乙醇要現用現配。在抽真空、震蕩的條件下進行脫水會提高脫水效果。

1.3.4 標本浸潤脫水結束后，將標本逐級浸入不同體積比的乙醇/Technovit 7200 VLC 樹脂( 70% /30%、50% /50%、30% /70%) 混合液中進行浸潤，每一步驟處理48 h，后置于100% Technovit 7200VLC 樹脂Ⅰ缸處理14天，100% Technovit7200 VLC 樹脂Ⅱ缸處理14天。注意浸潤過程中要避光，且溫度不超過25 ℃，每隔一段時間對樣本進行監控、檢查，避免其固化。值得注意的是，在抽負壓、真空條件下浸潤，可以使組織得到充分浸潤，且可以有效減少組織塊中殘存的氣泡。

1.3.5 光固化包埋聚合取出浸透完全的標本，將需要觀察的組織切面向下置入塑料包埋模具中，加入Technovit 7200VLC光聚樹脂，利用EXAKT 530 干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈組織塊內殘存的氣泡。固化過程由低強度的黃光與高強度的藍光共同輻照完成，先黃光輻照6h，后藍光輻照8h，經輻照光固化聚合后埋置有CF/PEEK 復合材料的肌肉組織樹脂包埋塊(圖1)。

1.3.6 平行粘片制作利用千分尺測量載玻片A的厚度，共計測量3次，取平均值，將聚合過的組織標本包埋塊從包埋模具中取出，利用Technovit 4000 粘合劑套裝將包埋塊粘于載玻片A 上。將粘附有標本包埋塊的載玻片A經真空吸附于EXAKT 300CP切片機樣本頭上，通過激光定位裝置，在包埋標本上進行定位，經帶鋸切割暴露出需要的切面，拋光后利用千分尺測量載玻片A、黏合劑、標本包埋塊的總厚度，共計測量3次，取平均值。另取一張載玻片B，利用千分尺測量載玻片B的厚度，共計測量3次，取平均值。在EXAKT 402載片黏合裝置上用Technovit 7210VLC精密粘合劑將載玻片B黏附于標本塊的拋光面，如此載玻片A、樹脂包埋標本塊、載玻片B合成一個類似三明治的結構，測量其總厚度，共計測量3次，取平均值，進而計算出膠的厚度，以便后續進行切片。

1.3.7 切片用EXAKT 300CP 硬組織切片機將包埋有組織標本的樹脂塊進行切割，一般將切割厚度設為200μm。值得注意的是，在切片過程中任何外力都會使切割面產生凹凸不平現象，因此切片過程中切勿施加外力干擾。切片完成后，取出切片，取下樣本塊，利用千分尺測量( 切片+ 膠+ 組織)總厚度，進而計算出實際切割下來的組織標本厚度。

1.3.8 磨片經EXAKT 400CS 硬組織磨片機進行磨片，先進行粗磨，再進行精磨，最后進行拋光，將組織磨至30μm厚。

1.3.9 組織切片的染色將組織切磨片經蒸餾水充分清洗后，參照文獻［5］的方法進行染色:蘇木精染液30 min，自來水充分沖洗，1%鹽酸乙醇分化30s，流水沖洗后再入溫水返藍，置伊紅染液5min，自來水沖洗，待組織切片自然干燥后經Technovit 7210VLC封片，光鏡下觀察。制得的組織切片經HE 染色后，細胞核、細胞質著色對比鮮明，組織細胞形態清晰，可直接在光學顯微鏡下進行組織學觀察，可見植入的CF/PEEK 復合材料與周邊肌肉組織結合緊密( 圖2、3) ，植入的復合材料周圍可見新生纖維結締組織，纖維囊壁結構已形成。

圖3 高倍鏡下埋置有CF/PEEK 復合材料的肌肉組織病理切片：a．試驗樣品CF/PEEK復合材料; b.肌肉組織

GB/T16886.6-2015 醫療器械生物學評價標準中提到對植入物的評價，要特別關注組織與材料之間的界面，且該標準推薦采用硬組織制片技術進行組織切片制作［4］。對埋置有種植體的組織標本進行制片時，硬組織切磨技術可以直接切含有堅硬植入物的組織標本，而普通的石蠟包埋組織切片需要先剔除組織內埋置的植入物，這往往會使原有的組織結構形態發生改變，無法客觀的評價植入物與周邊組織的結合情況，影響后期的評價分析。骨組織是由大量鈣化的細胞間質和骨組織細胞組成，為結締組織的一種，因細胞間質內有大量鈣鹽沉積，故骨組織質地十分堅硬，石蠟包埋組織切片必須對骨組織進行脫鈣處理［6－8］。脫鈣會使組織細胞皺縮，同時會使骨的礦化結構遭到破壞，而硬組織切磨技術無需脫鈣處理，完整的保存了骨組織的礦化結構，組織切片經染色處理后，可用于研究骨修復材料植入后的骨組織形態計量學及骨整合相關的研究。雖然樹脂包埋硬組織制片也存在不足，如制片過程復雜，制片操作步驟繁瑣，盡管存在難點，但硬組織切磨技術能夠保持種植體與周邊組織界面的組織結構，可直觀反應結合界面的生長結合情況，是目前研究種植體-組織結合界面重要的技術方法。